生物传感器相关概念简述（一）

旧城等待， 2023-07-03 02:56 70阅读 0赞

**生物传感器相关概念简述**

**An Overview of Biosensors**

# 一、荧光与化学发光 #

1.  荧光产生的原理

单线态、三线态、振动弛豫、内转换、体系间跨越

荧光与磷光的区别

1.  荧光激发光谱、荧光发射光谱、三维荧光光谱
2.  影响荧光量子产率的因素
3.  荧光猝灭的类型和机理

Stern-Volmer方程式

1.  如何识别荧光与散射光

Rayleigh散射和Raman散射

1.  如何利用荧光光谱进行定量分析

荧光定量公式

提高荧光发射强度的方法

1.  化学发光原理及常用的液相化学发光体系
2.  荧光光谱仪的基本构造

与UV的区别

1.  常用的荧光分析方法

直接分析法

间接分析法（猝灭）

FRET（基于FRET原理的分子信标）

荧光各向异性

荧光标记

示踪与细胞影像

# 二、生物传感器 #

1.  生物传感器的构成

1.  Bioreceptor（生物接收器）
2.  Transducer（转换器）

1.  Bioreceptor的种类

1.  酶   \-ase是英文中酶的后缀

Classification of Enzyme酶的种类如下:

Oxidoreductases(氧化还原酶)、Transferases(转移酶)、Hydrolases(水解酶)、Lyases(裂解酶)、Isomerases(异构酶)、Ligases(连接酶)

酶与底物反应，首先形成过渡态ES：E + Substrate = E\*S=E + Product，酶的催化作用可以使反应的活化能下降，催化过程符合Michaelis-Menten方程。反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度，称为米氏常数。

当酶的活性中心被占满的时候，底物浓度增加，反应速率也不会再增加。

脱氢酶可以催化还原性物质（或称为还原态物质Reduced substrate）跟NAD之间的H的转移，可以把还原性物质氧化。

Reduced substrate + NAD(P)+ =(在脱氢酶作用下)= Oxidized substrate + NAD(P)H + H+

Reduced dye + H2O2 =(peroxidase过氧化物酶)= Oxidized dye + H2O

1.  抗体

Immunology with label methods

1.    Competitive 竞争法

加入定量的经过酶标记的抗原分子，与未知浓度的抗原分子进行竞争性抗原抗体结合。

2.    Sandwich 三明治法

在抗体中，Constant region 称为保守区，其氨基酸序列是始终不变的，Variable region可变区的氨基酸序列是可变的，针对不同的抗原，有不同的序列。因此一种抗原对应一种抗体，因为此处的序列改变会影响到抗体构象，其对于被检测分子的空间适配性也会发生改变。选择性从化学根本的原因来说，是空间的适配性，就像钥匙插到锁里面。

1.  ssDNA（单链DNA）
2.  Molecular Beacon（分子信标）
3.  Aptamer（核酸适体）
4.  Synthetic receptor（合成受体）

1.  Transducer的种类

1.  电化学（电位，电流）
2.  光学（光吸收，荧光，光干涉，SPR）

光学传感检测的量：

1.      Absorption

2.      Emission

3.      Reflection反射

4.      Refractive index折射，例如SPR

5.      Scattering散射，例如拉曼光谱

1.  振荡频率（QCM）

1.  常用的标记方法

常用的标记方法：

1.  放射性同位素标记Radioactive Isotopes，例如碘125，除非要求灵敏度特别高，否则不采用
2.  荧光标记Fluorescent labels，使用高量子产率的荧光物质标记，可以是有机分子，也可以是量子点
3.  化学发光标记Chemiluminescent labels

（以上为光学方法）

1.  电活性物质标记Electroactive labels
2.  酶标记Enzyme labels
3.  金属标记Metallic labels（纳米金）

（以上为电化学方法）

# 三、纳米分析化学 #

纳米分析中的信号响应机理

0维材料：particle；1维材料：纳米线、纳米棒；2维材料：石墨烯，硫化钼等。

1.  纳米电分析

基于零维纳米材料（纳米颗粒particle）的电化学生物传感器原理

基于零维材料的电化学分析：一是用纳米粒子标记生物分子用于电化学传感（标记方法、电化学免疫分析和DNA检测）；二是用纳米粒子构筑电化学界面促进生物分子的电子转移；三是纳米粒子的光电化学。

尺寸效应有两种：一种是局域表面等离子共振；另一种是光的散射。发生表面等离子共振是不太容易的，因为光的耦合发生共振，共振需要一定的波长，一定的相位。光照射金纳米颗粒，非常容易耦合，因为是纳米金颗粒球形的，所以只要波长合适就可以耦合。光的电场和磁场会引起金属表面的金自由电子发生振荡，自由电子的振荡也有表面等离子波，但是是局限在金纳米颗粒表面的，因此叫做Local Surface Plasmon Effect（LSPR）。如果光的波长合适，就可以与表面等离子波的频率一致，就可以达到共振，这束光就会被吸收，就会产生颜色，光被吸收就会有颜色。表面等离子共振能产生多大的吸收，与极化率有关系，而极化率又与金属表面的介电常数有关系。金的极化率与银不同，相同直径的金纳米颗粒和银纳米颗粒，两者的表面等离子吸收完全不同，极化率也会影响到拉曼的散射。

纳米金不同的颜色不是完全由于吸收造成，吸收只是一部分，还有一部分是由于光的选择性散射，这两部分的叠加效应我们称之为消光，Extinction=Scattering+Absorption，所以在测量纳米金光谱的时候，纵坐标必须是E。对于纳米金属颗粒，纵坐标不应该是吸光度，而应该是消光，其由散射和吸收叠加而成。结果图的坐标轴选取方面，物理系的人喜欢横坐标用eV，化学系喜欢用wavelength。

纳米金一般由氯金酸还原所得，还原时使用的还原剂其还原性不能太强，若太强则容易生成大颗粒，常用的例如柠檬酸。纳米金尺度越小越偏红，尺度越大越偏蓝。明场看到的是通常是吸收引起的，看到的是互补光，这是光的互补性。高锰酸钾为什么是紫红色的，因为高锰酸钾吸收的是黄绿色的光。暗场的光是激发后产生辐射跃迁。

纳米材料的特性：一是表面效应，大量的原子暴露在表面，还可以与其他东西配位，表现出高活性以及吸附作用，所以现在很多催化剂都是纳米尺度的。吸附是很重要的，如果没有吸附，就不会对材料的电学性质以及光学性质产生影响；二是体积效应，当尺寸接近德布罗意波长时，颜色会发生变化，例如SPR；三是量子尺寸效应，此时的纳米颗粒需要接近波尔半径，一般在几个纳米，即便是十几个纳米也不行；四是宏观量子隧道效应。Tunnel effect。隧道扫描显微镜STM就是基于此原理。STM的工作原理是，探针与表面的距离越小，隧穿电流约大。

金薄膜的是SPR，金微球的是LSPR。

一维纳米材料在电化学分析中的应用

碳纳米管的修饰方法

碳纳米管，可分为单层和多层，即Single wall carbon nanotube和Multi wall carbon nanotube。其作用是可以实现直接电子转移，direct electron transfer，DET。

纳米的非标记传感器，例如碳纳米管，只需要吸附bonding，器件的特性曲线就会变化，而且只要bonding一些小分子就会变化，比SPR更灵敏。

甲烷是推电子气体。纳米线的宽度要合适，通过测量纳米线吸附气体后的电阻变化为原理做传感。

基于碳纳米管的场效应管FET传感器

以Si作为基底，将Si基底的表面氧化，氧化后形成很薄的一层二氧化硅，作为绝缘层，在绝缘层上涂两个金电极，两个金电极之间构成源、漏极，源极是source，漏极是drain，在源极和漏极之间是一个碳纳米管，由于碳纳米管是导电的，因此在施加源漏极电压后，可以产生电流。

如果在Si基底上再施加一个电压，这个电压就是栅极电压，栅极是gate。施加这个电压会改变碳纳米管的导电特性。场效应管的名称由来是：因为Si和碳纳米管之间还有绝缘层，所以栅极电压不是直接加到了碳纳米管上，而是对碳纳米管施加了电场，这个电场的引入，改变了碳纳米管的导电性能。

我们可以通过控制源漏极的电压和栅极电压，来测量器件特性曲线Device Characteristics。FET有两条器件特性曲线：一是改变源漏极电压，测量源漏极之间的电流，有点类似于电阻，此时的栅极电压是固定的，不同的栅极电压下可以有不同的器件曲线；另一种是，改变栅极电压，测量源漏极之间的电流。

假如该碳纳米管是N型的，则电子是主要的载流子，若栅极施加正电场，则会吸引载流子贴合到绝缘层，此时导电能力会增加。假如是P型半导体，若栅极还是施加正电场，则主要载流子就会被排斥，远离绝缘层，此时导电性能会下降。因此FET可以用于测量该纳米材料是P型半导体还是N型半导体。

假设栅极电压从\-40扫描到\+40V，源漏极之间的电流逐渐减小，则说明是P型半导体。

1.  纳米光学分析

纳米材料的光学响应机理（LSPR、纳米粒子聚集、表面折射率改变）

纳米材料在光学领域的应用，真正被医学接受的，是胶体金（纳米金）。纳米金表面连接抗体，抗原将纳米金抗体与抗体之间完全结合在一起，将纳米金由聚集态变为分散态，颜色发生显著变化。

纳米颗粒也会产生类似于自旋耦合的现象，靠近的纳米金颗粒的表面等离子波会相互影响，纳米金颗粒之间靠近，则LSPR峰会右移，拉开了又会回到原来的位置，基于此原理发展出aggregation sensor

半导体量子点的光学特性以及应用

量子点（Quantum Dots）通常以CdSe为核，CdS或ZnS为壳的核\-壳型纳米体，与传统的有机染料相比，其具有独特的性质。不同尺寸的量子点会有不同的发光颜色，体积越小，能带越宽的尺寸效应。纳米粒子的尺寸变小，接近波尔半径，出现显著的量子尺寸效应，导带能级向负移动，价带能级向正移动，能隙增加，能带蓝移。

与有机染料相比，量子点的优势在于：1.例如和罗丹明分子（Rohdamine）相比，量子点的激发光谱非常宽，很多波长都能使其激发， 同时其发射光谱窄，这是非常好的特性；2.另外，量子的量子产率比较高，例如荧光素（Fluorescein），在不同的波长下有不同的量子产率。而作为标记而言，量子产率显然更加明亮；3.量子点能够抵抗光的漂白，有机染料在强光的照射下会自然漂白。

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正是由于以上特性，量子点常用于生物成像，表面借各种各样的有机官能团或者靶向性的物质。例如，用疏水的改良聚丙烯酸包被量子点，使之与免疫球蛋白G和链霉亲和素相结合，使其能准确地结合并标记在细胞表面蛋白、细胞支架蛋白和细胞核内的蛋白质上。这种是主动靶向的方法，也可以使用被动靶向的方法，例如，因为肿瘤组织血管的密度和正常组织不一样， 其对纳米材料的渗透性会好一些，纳米材料会自动往这些部位聚集。

为什么量子点都是半导体，因为对于半导体而言，其能带随着尺寸的变化会有一些改变：若是非纳米状态的固态半导体bulk solid，是间隔很小的能带，能带之间的间隔非常小，几乎无法分辨，因此感觉上是连续的。处于下面的是价带，上面的是导带，价带一般充满了电子。价带与导带之间的宽度是禁带宽度。为什么叫半导体，就是因为其禁带宽度适中。绝缘体的禁带宽度非常大，电子很难从价带跳到导带。金属的价带和导带几乎是交错在一起的。因此金属在常温下，大量的自由电子可以移动。随着尺寸减小，构成物体的粒子数减小，最小的时候就是分子能级图，量子点就介于分子能级图和固态能级图之间。随着尺寸的减小，禁带会越来越大。

对于宏观物体，要克服一个势垒，因此需要做功，要先到山顶，然后下来。对于小尺寸的particle，例如光子，可以直接穿越势垒。两个相靠很近的金纳米颗粒，若施加电场，当存在Gap的情况下，电子也是可以转移过去。此处的Gap可以视为势垒。

例如，在免疫标记电化学发光中，吡啶钌与电极没有直接接触，但是吡啶钌的电子同样可以转移到电极上，这就是量子隧穿效应。

# 四、电化学中的过电位问题 #

对于分子量较大的物质，若使用普通的电极，也能发生电子传递，但是其过电位非常大，overpotential，如图中的a到a1。过电位是指，实际发生的氧化或还原的电位与其平衡氧化还原电位之间的差距。假设某分子，0.3V就可以还原，因为其能斯特电位就在0.3V，此处的能斯特电位就是平衡电位，但是实际实验中我们发现\-0.8V才能还原，再例如，氢气的电极电势是0，但氢气的实际还原电位是负的一点多。过电位产生的原因是：一是浓差极化，由于本体溶液扩散不及时，所以电极表面物质浓度迅速降低；二是电化学极化，电子传递速度太慢，所以会存在过电位，一般分子越大，过电位越大，因为分子越大，其电活性中心与电极表面的电子传递会变慢。碳纳米管的作用，可以降低过电位，从而使得选择性大大提高，因为假如要0.6V才能氧化，那么血液中的很多物质都能氧化。电化学中低电位氧化还原是一种很重要的提高选择性的方法。往往通过加入电子媒介的方法降低过电位。

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对于过电位的处理，可以参考以下例子：葡萄糖氧化酶催化了氧气跟葡萄糖反应，将葡萄糖氧化，氧气变成双氧水。因此可以通过检测氧气的衰减或双氧水的提高，从而间接地定量葡萄糖。另一种体系是：葡萄糖被葡萄糖氧化酶氧化成葡萄糖酸，葡萄糖氧化酶GOX被还原为还原态的GOX，二茂铁夺取还原态GOX的电子，从而将还原态的GOX重新变为氧化态的GOX，因此GOX是没有改变的，二茂铁变成还原态的二茂铁，还原态的二茂铁可以在电极表面发生电子传递，产生氧化电流。可以认为是二茂铁代替了氧气，而二茂铁的氧化还原在电极表面更加容易检测，因为其可逆性非常好。这种方法没有实现GOX与电极表面的直接电子转移，是非DET的。因此在该过程中，二茂铁是电子媒介体。

NADH辅酶催化葡萄糖体系：Glucose + NAD+（氧化态）在葡萄糖脱氢酶（GDH）的作用下，葡萄糖中H会转移到NAD+上面，所以葡萄糖就会被氧化，葡萄糖变成Glucose（ox），NAD+变成NADH。该反应的电子受体是NAD+。

GOX催化葡萄糖体系：Glucose+ O2在葡萄糖氧化酶（GOX）的作用下，生成Glucose（ox）以及双氧水。该反应的电子受体是氧气。

注：葡萄糖脱氢酶GDH，葡萄糖氧化酶GOX。

蛋白质有活性中心，即便蛋白质与电极很好地贴附，但是电活性中心在里面，因此很难与电子表面发生直接的电子转移，除非是纳米电极。

# 五、其他 #

关于控制纳米颗粒的间距，物理学家做的比较精确，而化学里，因为在溶液中，所以很难控制这个距离。物理学家可以通过气相沉积的方法，去做不同间隔距离的纳米材料，从而测量其消光光谱。

在合成的分子中，如果有巯基（\-SH）就能和金连接。

从发文章的角度，Discovery的东西，不需要检测浓度很高，也可以发表出来。

CDI Method：连接羟基与氨基

EDC Method：连接羧基与氨基或羧基与巯基

缓冲溶液的导电能力远远超过隧穿电流，隧穿电流会被流过缓冲溶液的电流掩盖。

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